固相萃取柱的實驗方法和技巧
為避免樣品在上液相色譜、氣相色譜、 LC-MS-MS、GC-MS時可能造成色譜柱或源的污染， 固相萃取成為去除雜質的必要手段，但經常會遇到柱子的選擇、溶劑的選擇、操作上的問題。通常說的過柱應該稱作柱層析分離，又稱柱色譜。文中以常用的硅膠或氧化鋁作固定相的吸附柱為例，探討分析了固相萃取柱壓、柱尺寸、無水無氧柱、干濕法上樣及實驗操作時遇到的問題，總結出固相萃取柱的實驗方法和技巧。
1 固相萃取柱的選擇與分類
1．1 柱壓力方式選擇 柱壓力可分為：減壓、加壓、常壓。減壓柱能夠減少固定相硅膠的使用量，缺點有：第一， 大量的空氣通過硅膠會使溶劑揮發（有時在固相萃取柱外面有水汽凝結）；第二，可能會造成易分解物質的損失；第三，抽氣泵的使用，會延長過柱萃取時間，增加噪音。固相萃取柱加壓是一種較好的使用方式，特別適用于易分解樣品的分離。加壓可以增加淋洗劑的流動速度，減少產品收集時間，缺點是：第一，減低柱子的塔板數；第二，壓力過大，溶劑流速過快減低分離效果，所以柱加壓在普通的有機化合物的分離中較適用。其他條件相同時，常壓柱效率最高，但耗時，比如天然化合物的分離。
1．2 固相萃取柱的尺寸選擇 理想的固相萃取柱類型應該是內徑和長度均較大。柱長加大，相應的塔板數則高，柱內徑較大，進樣后樣品的原點則小（反映在柱子上就是樣品層較薄），分離度變大。缺點是采用內徑較大的萃取柱需較多的硅膠和溶劑，增加實驗成本。現在常用萃取柱直徑與長度比一般在1∶5～1∶10，固定相硅膠量是樣品量的30～40倍。萃取柱較短內徑較小，相應的塔板數則低，進樣后樣品的原點則大（反映在柱子上就是樣品層較厚，樣品層在固相萃取柱內小于0．5cm，各組分較容易完全分離），分離度變小。 如果所需組分和雜質分離度較大（所需組分分離度R＞1），使用硅膠較少、內徑較小的萃取柱（例如200毫克的樣品，用2cm×20cm的柱子）；如果所需組和雜質分離度較小（所需 組分分離度R＜1），可以加大萃取柱內徑，也可使用極性較小的淋洗劑等。
1．3 無水無氧柱 無水無氧柱適用于對氧、水敏感、易分解的產品，可以濕柱，也可以干柱。由于溶劑和硅 膠飽和時放出熱量可能導致分析樣品中化合物的分解，樣品過柱前要用溶劑將萃取柱飽和一次。分離較敏感物質，必須選用密封的接收瓶，遵循Schlenk操作，至于是加壓、常壓、減壓，隨需而定。氧化鋁常用作無水無氧柱的固定相。氧化鋁可以做成堿性、中性和酸性的，選擇范圍較大，但成本較高。硅膠中有大量的羥基裸露在外，樣品容易分解，尤其是金屬有機化合物和含磷化合物，一般較少使用。
1．4關于濕法、干法上樣 濕法上樣操作簡單，一般用淋洗劑溶解樣品，常用溶劑如二氯甲烷、乙酸乙酯等，為防止溶劑成為淋洗劑，溶劑越少越好。有些樣品在上柱前較粘稠，但對結果影響較小，有些濃度較大樣品上樣后在硅膠上有析出現象，分析原因是硅膠對樣品的吸附達到飽和，而樣品本身溶解度較低造成的，遇到這種情況應該先重結晶，得到大部分的化合物后再做柱分離，如果不能重結晶，直接過柱，樣品隨著淋洗劑流動會自動溶解。 若有些樣品溶解性差，溶解的溶劑又不能上柱（比如DMF、DMSO等，會隨著溶劑一起 走， 顯色有個很長的脫尾），此時必須用干法上柱。樣品和硅膠的量的比例為1∶1，總量越少越好， 分離結果要保證在旋干后，無明顯固體顆粒析出（說明有的樣品沒有吸附在硅膠上）。
1．5淋洗劑的選擇
1．5．1 淋洗劑的要求
a．揮發性小，在操作溫度下有較低蒸汽壓，以免流失；
b．熱穩定性好，在操作溫度下不發生分解；
c．對試樣組分有適當的溶解能力；
d．具有較高的選擇性，即對沸點相同或相近的不同物質有盡可能高的分離能力；
e．化學穩定好，不與被測物質發生化學反應。
1．5．2淋洗劑的選擇 （1）分離非極性物質，一般選用非極性淋洗劑，這時試樣中的各組分按沸點次序先后流 出。 （2）分離極性物質，選用極性淋洗劑，這時試樣中的各組分按極性順序分離，極性較小的先流出，極性較大的后流出。（3）分離非極性與極性混合物時，一般選用極性淋洗劑，這時非極性部分先流出，極性部分后流出。 （4）對于能形成氫鍵的試樣，如醇、酚等的分離，一般選擇極性的或是氫鍵型的淋洗劑，這時各組分按與淋洗劑之間形成的氫鍵能力大小先后流出。 （5）對于較難分離的物質，可以用兩種或兩種以上的淋洗劑。有時我們為了節約成本經常購買大包裝或桶裝的淋洗劑，這些大多是工業用品，雜質較多，所以在比較嚴格的柱分時有必要對溶劑重蒸（過原料時就可以節省次步驟）。另外溶劑在過柱子后也回收利用，一方面環保，另一方面也能節約部分經費，缺點是耗時。過柱時石油醚和乙酸乙酯的揮發度不同會導致極性的變化，一般會導致極性變大，此方式較適合梯度淋洗。樣品過柱分離后，為防止減壓旋蒸時有部分低沸點雜質吸出，溶劑最后回收要采用常壓，這時純化回收效果較好。
2 柱萃取操作問題
2．1 裝柱 柱子下的活塞避免使用潤滑劑，以免被淋洗劑帶到產品中。干法和濕法裝柱區別較小，只要能把柱子裝實即可。裝柱前應仔細觀察固相萃取柱是否開裂，避免影響分離效果，裝柱應該要適度緊密（太緊密淋洗劑流速太慢，太疏松淋洗劑流速過快）、均勻（避免樣品從一側斜著流出），避免過柱時出現大量的氣泡。
2．2 加樣 用少量的溶劑溶樣品加樣，打開活塞，待溶劑層下降至石英砂面時，再加少量的低極性溶劑，然后再打開活塞，如此三次，一般石英變成白色。加入淋洗劑后不可立即加壓，等溶樣品的溶劑和樣品層有分開2cm～4cm，再加壓，這樣可以避免溶劑（如二氯甲烷等）夾帶樣品快速下行。
2．3 樣品的收集 用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡過程。如果樣品與硅膠的吸附較強，樣品解析較慢。這樣就會出現后面的點先出，而前面的點后出的現象，這時可以采用氧化鋁作固定相。另外，收集的試管大小要以樣品量而定，特別是小量樣品，如果用大試管，可能一根就收到了多個樣品，如果都用小試管，缺點是工作量太大。
2．4 最后處理 萃取柱分離后，由于使用了大量的溶劑，其中的雜質也會積累到所需組分中，必要時進 行重結晶。另外， 過柱時有時會出現氣泡，這可能存在兩種原因：一是這與使用的溶劑類型有關，如果是易揮發的溶劑，如乙醚、二氯甲烷等，在室溫稍高的情況下，很容易出現這種現 象。因此，在室溫高的時候，應該選擇沸點較高，揮發性相對小的溶劑。
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